抗體-藥物偶聯物（Antibody-Drug Conjugate, ADC），其核心設計理念是利用抗體的靶向性，將高細胞毒性的小分子藥物（Payload）精準遞送至腫瘤細胞內部，從而實現高效殺傷并降低全身毒副作用。然而，一款成功的ADC藥物，其療效絕非簡單的“抗體"加“毒素"，關鍵在于連接子（Linker）穩定性和抗體能否被高效內化（Internalization）并在胞內被及時降解（Degradation）以釋放Payload。

 一、 為何內化與降解檢測至關重要？

在ADC的作用機制中，內化與降解是承上啟下的核心步驟：

1.  內化（Internalization）：ADC與細胞膜表面的靶抗原結合后，通過網格蛋白介導的內吞作用等途徑進入細胞，形成內體（Endosome）。
   
   

2.  降解（Degradation）：內體逐漸酸化并成熟為溶酶體（Lysosome），在溶酶體內豐富的蛋白酶和酸性環境下，抗體部分被降解，同時裂解型的連接子斷開，釋放出游離的有效載荷（Payload），進而發揮殺傷作用。

 二、 核心檢測技術匯總

目前，針對內化和降解的檢測技術多樣，可根據檢測原理和目的進行分類應用。

• 基于pH敏感染料的內化效率檢測

       原理：pH敏感染料在中性pH環境下無熒光，一旦進入酸性胞內環境（pH<6），熒光強度顯著增加。將抗體標記pH敏感型試劑后，其熒光強度與內化程度直接相關。

       優勢：背景信號極低，靈敏度高，特別適合高通量篩選（HTS）。

       應用：96或384孔板形式的大規模抗體庫初篩。

*信號出現在環境 pH 達到 pKa 之前。

即用型：

• 高敏感性：pH-sensitive IgG labeling reagents 試劑與目的一抗的Fc段快速、定量地結合，形成預復合物。該試劑上已共價連接了pH敏感型染料。無需對一抗進行繁瑣的化學偶聯，即可實現幾乎任何來源的IgG一抗的標記，極大拓寬了應用范圍并節省了時間。
  
  

• 操作便捷：試劑與抗體孵育10-20分鐘→復合物與細胞孵育→流式檢測
  
  

• 低背景：未內化的抗體不會發光，有效避免了膜表面結合抗體對內部化信號的干擾。
  
  

染料：

抗體&蛋白通用：任何在賴氨酸殘基上含有伯胺基或半胱氨酸氨殘基上含有巰基的蛋白質均可與染料進行偶聯。

應用廣泛：流式細胞術、熒光顯微鏡、熒光成像系統和高通量篩選（HCS）

驗證數據：

綠色熒光	紅色熒光	深紅熒光

2、基于細胞殺傷的內化效率檢測- DT3C重組蛋白

DT3C是一種重組表達的融合蛋白，與抗體Fc端高度親和，結合后的DT3C分子在抗體被內吞時一同進入細胞。DT3C釋放出具有毒性的DT，阻斷蛋白翻譯過程，最終導致細胞死亡。

通過MTT, WST-1, UA-Glo細胞活力檢測試劑盒(UA070103)等方法，檢測細胞活力或細胞死亡情況，從而評估抗體的內化效率。

數據展示：

 3、降解與Payload釋放檢測技術

1）液相色譜-質譜聯用（LC-MS/MS）

原理：目前金標準方法。通過高靈敏度的質譜技術，直接定量檢測細胞裂解液中釋放出的游離小分子Payload及其代謝產物的絕對含量。

優勢：靈敏度（可達皮摩爾甚至飛摩爾級別），可同時進行定性和定量分析，提供最直接的Payload釋放證據。

應用：ADC藥效評估、連接子穩定性測試、代謝動力學研究。

2）免疫印跡（Western Blot）與免疫沉淀（IP）

原理：利用針對抗體Fc段、獨特型（Idiotype）或Payload的特異性抗體，檢測細胞裂解液中ADC降解片段或釋放的Payload。

優勢：可提供降解產物的分子量信息，特異性高。

劣勢：半定量，操作繁瑣，通量低。

3）報告基因法（Reporter Gene Assay）

原理：構建一種工程細胞系，其Payload（如某種毒素）激活的細胞殺傷效應與一種報告基因（如熒光素酶Luciferase）的活性呈負相關。Payload釋放越多，細胞活性越低，報告信號越弱。

優勢：功能性地反映Payload的整體生物學效應，通量高。

劣勢：是間接檢測，易受其他因素干擾。

相關產品推薦：

抗payload抗體

部分驗證數據：

報告基因檢測試劑盒

三、 技術整合與未來展望

在實際的ADC研發項目中，通常不會依賴單一技術，而是多種技術聯用，相互驗證。例如：

   初篩階段：使用pHrodo或流式細胞術進行高通量內化篩選。

   機制驗證：采用共聚焦顯微鏡觀察內化路徑和溶酶體共定位。

    最終驗證：運用LC-MS/MS金標準方法精確量化Payload的釋放量和動力學。

抗體的內化與降解是ADC藥物發揮“精準殺傷"效應的命門所在。一套成熟、完善且不斷創新的內化與降解檢測技術體系，如同為ADC研發人員裝上了“火眼金睛"，能夠穿透細胞膜，洞察內部的運作細節。通過對這些關鍵過程的深刻理解和精準量化，研究者能夠更高效地篩選出最佳候選藥物，優化連接子技術，最終加速開發出更安全、更有效的ADC療法，造福全球癌癥患者。