一、什么是ELISA？為何優化步驟至關重要？

酶聯免疫吸附試驗（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一種基于抗原與抗體特異性結合的高靈敏度免疫化學分析技術，廣泛應用于生物醫學研究、臨床診斷和藥物開發領域。其核心原理是通過酶標記的抗體或抗原與目標分子結合，借助酶-底物反應產生可檢測信號，實現對目標分子的定性或定量分析。

盡管ELISA技術成熟度高，但其結果易受多種因素影響，包括包被條件、封閉效率、樣品基質、抗體選擇及信號檢測系統等。若未對實驗條件進行系統優化，可能導致靈敏度下降、背景信號升高或重復性差等問題。因此，科學地優化ELISA的各個環節是確保數據準確性與可靠性的關鍵。

二、如何優化抗原包被步驟？

抗原包被是ELISA實驗的起始步驟，其質量直接決定后續反應的特異性和靈敏度。優化時需考慮以下因素：

• 包被濃度與體積：需通過棋盤滴定法確定抗原或捕獲抗體的最佳濃度，避免濃度過低導致信號弱或過高引起空間位阻。

• 包被緩沖液選擇：常用緩沖液包括磷酸鹽緩沖鹽水（PBS, pH 7.4）和碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）。堿性環境有助于蛋白質通過疏水作用與聚苯乙烯板結合，但某些敏感蛋白可能需中性條件以維持構象。

• 包被條件：通常在4℃過夜或37℃孵育1–2小時。低溫長時間包被有助于蛋白穩定吸附，而高溫短時包被可提高效率。

• 板類型選擇：高結合力聚苯乙烯板適用于大多數蛋白質抗原；對于脂質或疏水性抗原，需選用疏水表面板，并使用醇類溶劑溶解抗原。

若包被不完整或過量，均會導致信號異常。建議通過預實驗確定能使孔底充分覆蓋的最小蛋白濃度，并避免后續洗滌步驟中涂層脫落。

三、為何封閉步驟十分重要？如何選擇封閉劑？

封閉的目的是覆蓋孔板中未被抗原占據的剩余結合位點，防止檢測抗體非特異性吸附，從而降低背景信號、提高信噪比。常用的封閉劑包括：

• 蛋白質類：如牛血清白蛋白（BSA）、脫脂奶粉或動物血清。BSA適用于多數實驗，但若檢測抗體與BSA存在交叉反應，需改用其他封閉劑。

• 非蛋白類：如酪蛋白、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或合成多聚物，適用于避免蛋白干擾的實驗體系。

封閉時間一般為1–2小時，溫度以37℃為宜。需注意，封閉劑濃度過高可能抑制特異性結合，而過低則封閉不充分。建議通過對比實驗篩選最佳封閉劑及其濃度。

四、樣品制備中應注意哪些關鍵問題？

樣品基質的復雜性常對ELISA結果產生顯著影響，優化樣品處理流程至關重要：

• 稀釋液選擇：應盡量模擬樣品基質，例如使用含0.05% Tween-20的PBS緩沖液（PBST）并添加0.1–1% BSA作為稀釋液，以減少非特異性結合。

• 基質效應評估：通過加標回收實驗驗證稀釋液兼容性。將已知濃度標準品加入待測樣品中，計算回收率（通常要求80–120%），確保基質成分不干擾檢測。

• 樣品前處理：對于血清樣本，需考慮補體滅活（56℃加熱30分鐘）以避免假陽性。但需注意熱敏感蛋白可能變性，需優化滅活條件。

• 稀釋倍數優化：通過多梯度稀釋確保檢測值落在標準曲線線性范圍內，避免因濃度過高或過低導致定量偏差。

五、如何科學選擇檢測抗體？

檢測抗體的質量直接影響ELISA的特異性和靈敏度：

• 抗體類型：單克隆抗體特異性高、批次間穩定性好，適用于高特異性檢測；多克隆抗體結合表位多樣，靈敏度較高但易出現交叉反應。

• 配對驗證：在夾心ELISA中，需確保捕獲抗體與檢測抗體識別不同表位，且無空間位阻。可通過文獻調研或實驗驗證抗體兼容性。

• 滴定優化：通過稀釋曲線確定檢測抗體的最佳工作濃度，選擇信噪比最高、背景低的濃度點。

六、酶偶聯物與底物應如何搭配？

酶標記系統是信號放大的核心，常用酶包括辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（ALP）：

• HRP系統：穩定性好、成本低，常用底物為TMB（顯藍色，靈敏度高）、ABTS（顯綠色，動態范圍寬）和OPD（顯橙色，已較少使用）。反應可通過酸性溶液終止。

• ALP系統：適用于堿性環境，底物如pNPP顯黃色，反應線性范圍較寬，但酶穩定性略低于HRP。

• 選擇原則：需根據檢測靈敏度、反應速度、信號穩定性及設備兼容性綜合考慮。例如，TMB適用于動力學檢測，而ABTS更適合需要寬動態范圍的終點法檢測。

七、不同信號檢測方式有何優劣？

根據檢測目標選擇合適的信號讀取方式：

• 比色法：常用，設備要求低，操作簡便，但動態范圍較窄。

• 熒光法：靈敏度高，動態范圍寬，需使用黑板和熒光酶標儀，但信號穩定性較差。

• 化學發光法：靈敏度可達pg/mL級別，背景低，但信號衰減快，需及時檢測。

選擇時需權衡檢測靈敏度、儀器可用性及實驗通量需求。

八、如何系統驗證ELISA方法的可靠性？

完整的ELISA優化應包括以下驗證指標：

• 標準曲線：線性范圍應覆蓋待測樣品濃度，R2 > 0.99。

• 精密度：板內和板間變異系數（CV）應低于10%和15%。

• 靈敏度：以空白信號均值加2倍標準差計算檢測下限（LOD）。

• 特異性：通過交叉反應實驗驗證抗體與非目標抗原的結合情況。

結語

ELISA作為一種經典且靈活的檢測技術，其優化過程需系統考慮抗原包被、封閉、樣品處理、抗體選擇、信號放大及檢測等多個環節。通過科學設計優化策略并嚴格驗證方法性能，可顯著提升實驗的準確性、重復性與適用性，為生物學研究與臨床檢測提供可靠工具。

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如何系統優化ELISA實驗以獲得可靠結果？