在免疫系統(tǒng)的精密布局中，輔助性T細(xì)胞17（Th17）作為CD4+T細(xì)胞的重要亞群，扮演著抵御細(xì)胞外細(xì)菌和真菌感染的關(guān)鍵角色，同時(shí)也是自身免疫疾病的強(qiáng)力推動者。無論是研究黏膜免疫、感染防御，還是探索自身免疫病的發(fā)病機(jī)制，掌握體外Th17細(xì)胞極化技術(shù)都成為核心技能！

面對復(fù)雜的細(xì)胞因子組合和精細(xì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，你是否對Th17極化感到無從下手？放心，這篇"Th17極化指南"將為你揭開所有謎團(tuán)，帶你從基礎(chǔ)到精通，全面掌握人與小鼠Th17極化的精髓！

第一部分：理論基石——Th17細(xì)胞的雙面特性

1.Th17細(xì)胞是什么？

Th17細(xì)胞是近年來備受關(guān)注的CD4+T細(xì)胞功能亞群，其特征性分泌IL-17A、IL-17F、IL-22等細(xì)胞因子。它們是黏膜免疫的"守護(hù)者"，通過招募中性粒細(xì)胞和維持上皮屏障完整性，構(gòu)筑起抵御真菌和細(xì)胞外細(xì)菌感染的第一道防線。然而，當(dāng)調(diào)控失常時(shí)，它們又會轉(zhuǎn)化為"炎癥風(fēng)暴的引爆者"，驅(qū)動多種自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。

2.為什么要進(jìn)行體外Th17極化？

機(jī)制探索：解析TGF-β、IL-6等關(guān)鍵因子在Th17分化中的協(xié)同作用機(jī)制

疾病研究：獲取Th17細(xì)胞用于研究銀屑病、多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫病

藥物篩選：建立Th17相關(guān)疾病模型，篩選靶向Th17通路的新型治療藥物

免疫平衡：研究Th17/Treg平衡在免疫穩(wěn)態(tài)中的調(diào)控作用

第二部分：核心庫——極化因子全解析

Th17分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)相對復(fù)雜，其極化條件需要精確的細(xì)胞因子組合和適當(dāng)?shù)囊种苿┦褂谩?/p>

"經(jīng)典三要素"信號通路：

? TCR激活信號：通過抗CD3/CD28抗體提供T細(xì)胞活化的基礎(chǔ)信號
? TGF-β+IL-6協(xié)同啟動：TGF-β與IL-6的組合是啟動Th17分化的核心驅(qū)動力，誘導(dǎo)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RORγt表達(dá)
? 細(xì)胞因子強(qiáng)化網(wǎng)絡(luò)：IL-1β和IL-23可進(jìn)一步促進(jìn)Th17細(xì)胞的增殖和功能穩(wěn)定

精準(zhǔn)調(diào)控策略：

? 抗體阻斷方案：使用抗IFN-γ和抗IL-4抗體，有效消除Th1和Th2分化的競爭干擾
? 信號通路調(diào)節(jié)：通過適當(dāng)抑制STAT1/STAT4/STAT5信號，為Th17分化創(chuàng)造有利環(huán)境

這套經(jīng)過優(yōu)化的極化體系能夠高效誘導(dǎo)初始CD4+T細(xì)胞分化為功能成熟的Th17細(xì)胞，其典型特征包括大量分泌IL-17A、高表達(dá)RORγt和CCR6等表面分子，為深入研究Th17生物學(xué)功能提供理想的實(shí)驗(yàn)平臺。

第三部分：實(shí)戰(zhàn)操作篇——小鼠與人Th17極化方案

小鼠Th17極化方案

1.細(xì)胞培養(yǎng)

用10?µg/ml anti-mouse CD3ε mAb和2?µg/ml anti-mouse CD28 mAb包被48孔細(xì)胞培養(yǎng)板過夜;

第二天洗板封閉后加入分選后的CD4+ T細(xì)胞，培養(yǎng)基用RPMI-1640 加10 μg/mL anti-IFN-γ,10 μg/mL anti-IL-2, 10 μg/mL anti-IL-4, 50 ng/mL IL-6, 30 ng/mL TGF-β1, 10 ng/mL IL-23 , 50 ng/mLIL-1β, 55 μM β-巰基乙醇及10 % FBS培養(yǎng);

48 小時(shí)開始每 12 小時(shí)觀測細(xì)胞濃度，如果細(xì)胞密度很大，則將細(xì)胞分到新的孔中，并加以上培養(yǎng)液刺激（不用添加CD3,CD28抗體刺激）;

培養(yǎng)5天后收集細(xì)胞細(xì)胞，將胞密度控制為10?/ml，用10ng/ml PMA,1μg/ml Ionomycin,10μg/ml Brefeldin A共處理5h。

陰性對照組Th0細(xì)胞：用10?µg/ml anti-mouse CD3ε mAb和2?µg/ml anti-mouse CD28 mAb包被48孔細(xì)胞培養(yǎng)板過夜;

第二天洗板封閉后加入分選后的CD4+ T細(xì)胞，維持培養(yǎng)基為RPMI-1640 加 10 % FBS, 55 μM β巰基乙醇，10μg/mL anti-mouse IFNγ，10μg/mL anti-mouse IL-4 培養(yǎng);

48 小時(shí)開始每 12 小時(shí)觀測細(xì)胞濃度，如果細(xì)胞密度很大，則將細(xì)胞分到新的孔中，并加以上培養(yǎng)液（不用添加 anti-mouse CD3ε和anti-mouse CD28 mAb）培養(yǎng)5天。

2、流式檢測

收集細(xì)胞后用流式檢測抗體染色上機(jī)

BD Mouse IL-17A PE (clone: TC11-18H10.1)

Th17 Polarization Kit, Mouse/小鼠Th17極化套裝_UA090020_優(yōu)愛(UA BIOSCIENCE)

B. 人Th17極化方案

1、細(xì)胞培養(yǎng)

用5?µg/ml CD3 抗體包被96孔細(xì)胞培養(yǎng)板過夜，第二天洗板封閉后加入用CD4 Nanobeads, human（S0B5740）分選后的CD4+ T細(xì)胞，培養(yǎng)基用RPMI-1640 加10 μg/mL IFN-γ抗體，10 μg/mL IL-4 抗體，30 ng/mL human IL-6, 10 ng/mL TGF-β1,20 ng/mL IL-23 ,20 ng/mL IL-1β, 55 μM β-巰基乙醇，1?µg/ml CD28抗體及10 % FBS培養(yǎng);

48 小時(shí)開始每 12 小時(shí)觀測細(xì)胞濃度，如果細(xì)胞密度很大，則將細(xì)胞分到新的孔中，并加以上培養(yǎng)液刺激（不用添加CD3,CD28抗體刺激）;

培養(yǎng)5天后收集細(xì)胞細(xì)胞，將胞密度控制為10?/ml，用10ng/ml PMA+1μg/ml lonomucin，10μg/ml Brefeldin A共處理5h。

陰性對照組Th0細(xì)胞: 用5?µg/ml anti-human CD3 mAb包被96孔細(xì)胞培養(yǎng)板過夜;

第二天洗板封閉后加入分選后的CD4+ T細(xì)胞, 培養(yǎng)基用RPMI-1640 加 10 % FBS, 55 μM β巰基乙醇, 10μg/mL Anti-human IL-4, 10μg/mL Anti-Human IFN-γ, 200U/ml IL-2 , 1?µg/ml anti-human CD28 mAb培養(yǎng);

48 小時(shí)開始每 12 小時(shí)觀測細(xì)胞濃度，如果細(xì)胞密度很大，則將細(xì)胞分到新的孔中，并加以上培養(yǎng)液刺激（不用添加CD3,CD28抗體刺激）培養(yǎng)5天。

2、流式檢測

收集細(xì)胞后用流式檢測抗體染色上機(jī)

抗體貨號 Thermo 25-7179-42 IL-17A Monoclonal Antibody (eBio64DEC17), PE-Cyanine7

Th17 Polarization Kit, Human /人Th17極化套裝_UA090019_優(yōu)愛(UA BIOSCIENCE)