斯達特生物致力于為科研工作者提供高質量的試劑盒產品和專業的技術支持。選擇我們的Mouse TNF-α OneStep ELISA Kit（S0C3023），您將獲得可靠的實驗結果和優質的售后服務，助力您的科研工作順利進行。

關于斯達特(Starter)，國產抗體專家：
杭州斯達特志在為全球生命科學行業提供優質的抗體、蛋白、試劑盒等產品及研發服務。依托多個開發平臺：重組免單抗、重組鼠單抗、快速鼠單抗，重組蛋白開發平臺 (E.coli,CHO,HEK293,InsectCells)，已正式通過歐盟98/79/EC認證ISO9001認證ISO13485.

一步法ELISA試劑盒因操作簡便、耗時短，廣泛應用于抗原/抗體檢測，但實驗過程中的細節把控直接影響結果準確性。以下是使用時的核心注意事項，涵蓋操作前、操作中及操作后全流程：  

一、操作前準備注意事項  

試劑盒與樣本準備  

試劑盒儲存：嚴格按照說明書溫度儲存（通常2-8℃，部分試劑需-20℃冷凍），避免反復凍融（尤其是酶結合物、標準品），取出后需在室溫（20-25℃）平衡30-60分鐘，確保各試劑溫度一致，減少誤差。  

試劑檢查：使用前核對試劑盒批號、有效期，觀察試劑是否渾濁、沉淀或變色（如酶結合物應為澄清液體，顯色底物A/B液若發黃可能失效），包裝破損或異常試劑禁止使用。  

樣本處理：  

血清、血漿樣本需避免溶血（紅細胞破裂釋放過氧化物酶會干擾顯色），離心后取上清，避免脂血、纖維蛋白凝塊。  

組織勻漿、細胞培養液等樣本需按說明書處理（如稀釋、離心），確保無顆粒雜質，必要時用0.22μm濾膜過濾。  

樣本應新鮮檢測，若需保存，需分裝后-20℃或-80℃冷凍，避免反復凍融（建議≤3次）。  

實驗器材與環境  

耗材選擇：使用配套96孔板（不可混用不同批次板條，吸附性能可能差異），移液器需校準（推薦使用可調式移液器，吸頭一次性使用，避免交叉污染）。  

環境控制：實驗溫度保持20-25℃（溫差過大影響反應效率），避免陽光直射、通風過強或振動（如靠近離心機），實驗臺需清潔干燥，準備吸水紙、計時器。  

二、操作過程關鍵注意事項  

加樣操作  

順序與量：一步法需同時加入樣本和酶結合物（或按說明書特定順序），加樣時沿孔壁緩慢加入，避免產生氣泡（氣泡會導致讀數偏低），若有氣泡用針頭挑破。  

避免交叉污染：每加完一個樣本/試劑需更換吸頭，加樣后輕敲板邊緣使液體混勻，切勿劇烈震蕩（防止液體濺出污染相鄰孔）。  

標準品與質控：標準品需按說明書梯度稀釋（稀釋液必須專用，不可用蒸餾水替代），每個濃度做復孔（通常2-3孔），同時設置空白對照（僅加顯色劑和終止液）和陰性/陽性對照，確保實驗有效性。  

溫育控制  

嚴格按照說明書時間和溫度溫育（如37℃孵育30分鐘），建議使用恒溫箱（避免用室溫替代，溫度波動會導致結果偏差），溫育時需加蓋板膜（防止蒸發濃縮或污染），板條應水平放置，確保液體覆蓋孔底。  

溫育結束后及時取出，避免超時（可能導致非特異性結合增加，背景升高）。  

洗滌步驟  

洗滌是減少背景的關鍵：使用專用洗滌液（按比例稀釋，避免用水替代），通過洗板機或手動加樣，每孔加液量需超過孔容量1/2（如每孔加300μL），浸泡30-60秒后棄去，重復3-5次（次數不足易殘留游離抗原/抗體，導致假陽性）。  

洗滌后需在吸水紙上拍干（切勿倒扣用力甩動，防止液體殘留交叉污染），確保孔內無可見液滴。  

顯色與終止  

顯色劑A、B需按比例混合（或分別加入），加樣后輕輕混勻，避光顯色（部分底物對光敏感），嚴格控制顯色時間（如15分鐘），觀察到標準品梯度顯色明顯后及時終止。  

終止液（通常為硫酸）需緩慢加入（避免劇烈反應導致液體濺出），加樣順序與顯色劑一致，終止后輕輕震蕩混勻，確保顏色由藍色（TMB底物）變為黃色，若仍為藍色可能終止不全。  

三、檢測與數據處理注意事項  

讀數時機：終止后10-30分鐘內用酶標儀讀數（超過1小時可能因顏色消退導致結果偏低），選擇正確波長，讀數前確保孔內無氣泡、液體澄清（若有沉淀需離心后取上清）。  

結果判斷：  

復孔OD值差異應≤10%，否則需重新檢測。  

空白對照OD值應≤0.1（超過則可能試劑污染或洗滌不當），陰性對照OD值需低于臨界值，陽性對照需高于臨界值，否則實驗無效。  

計算結果時需扣除空白對照OD值，按標準曲線計算樣本濃度，避免僅憑肉眼判斷顏色深淺。  

四、操作后注意事項  

試劑處理：剩余試劑需按原條件儲存（如酶結合物放回2-8℃，顯色劑避光保存），板條未用完部分需密封后2-8℃保存，標記使用日期。  

廢棄物處理：終止液含強酸，需中和后再倒入下水道，廢棄吸頭、板條按生物廢棄物處理，避免接觸皮膚。  

記錄與追溯：詳細記錄實驗日期、試劑批號、溫育時間、儀器型號等信息，便于結果追溯和問題排查。