The green fluorescent protein （GFP） is a protein that exhibit bright green fluorescence when exposed to blue light. It is a widely used reporter in gene expression and protein localization studies. the green fluorescent protein （GFP） from the jellyfish Aequorea victoria is a widely used reporter in studies of gene expression and protein localization. GFP is a single chain polypeptide of 238 amino acids .Most of these amino acids form β sheets that are compacted through an antiparallel structure to form the barrel. So far, they have been used as reporters of gene expression, tracers of cell lineage, and as fusion tags to monitor protein localization within living cells.
 

GFP重組的步驟遵循基因工程的基本框架，具體可分為以下6步：  

1.目的基因與GFP基因的獲取  

目的基因：通過PCR擴增從生物體基因組中獲取，或從基因文庫中篩選。  

GFP基因：可直接使用野生型GFP基因，或經過優化的突變體（如增強型EGFP，熒光強度更高、更穩定）。  

2.載體的選擇與制備  

載體是攜帶基因進入宿主細胞的“工具”，常用的有質粒（適用于細菌、酵母、哺乳動物細胞）、病毒載體（如腺病毒，適用于動物活體）等。  

載體需經過酶切處理，使其兩端產生與目的基因、GFP基因匹配的粘性末端，便于后續連接。  

3.基因連接：構建融合基因表達載體  

使用DNA連接酶，將目的基因、GFP基因按照一定順序（通常是目的基因在前，GFP在后，或反之，需根據蛋白結構設計）連接到載體中，形成“目的基因-GFP融合基因表達載體”。  

關鍵：確保融合基因的閱讀框（ORF）正確，否則會導致蛋白合成異常，失去熒光活性。  

4.轉化/轉染：將重組載體導入宿主細胞  

轉化：針對細菌、酵母等微生物，通過化學處理（如氯化鈣法）或電穿孔法讓細胞吸收載體。  

轉染：針對動物細胞，常用脂質體介導、病毒介導或顯微注射等方法。  

5.篩選與鑒定：獲得陽性克隆  

載體通常攜帶篩選標記（如抗生素抗性基因），通過抗性篩選可初步獲得成功導入載體的細胞。  

進一步通過PCR、測序等方法驗證融合基因是否正確插入，確保重組載體構建無誤。  

6.表達與熒光檢測  

誘導宿主細胞表達融合蛋白（如通過IPTG誘導細菌表達，或利用載體自帶的啟動子在特定條件下啟動表達）。  

使用熒光顯微鏡、流式細胞儀等設備，在藍光激發下觀察綠色熒光，驗證融合蛋白是否成功表達及定位。  

GFP重組的優勢與注意事項  

優勢：  

非侵入性：無需破壞細胞或組織，可活體、實時觀察。  

高特異性：僅標記目標分子，信號干擾少。  

操作靈活：可與多種基因、載體結合，適配原核到真核的多種宿主。  

注意事項：  

可能影響目的蛋白功能：GFP分子量約27kD，若與小分子蛋白融合，可能改變其空間結構，導致功能異常（需通過預實驗驗證）。  

熒光淬滅：長時間激發可能導致GFP熒光減弱，需控制觀測時間或使用抗淬滅試劑。  

啟動子選擇：需根據宿主細胞類型選擇合適的啟動子（如原核生物用lac啟動子，哺乳動物細胞用CMV啟動子），確保GFP正常表達。